亚洲城ca88唯一官方网站,核心提示:使用前处理: 1. 把透析袋剪成适当长度的小段。 2.
在大体积的2%碳酸氢钠和 1mmol/L EDTA中将透析袋煮使用前处理: 1.
把透析袋剪成适当长度的小段。 2. 在大体积的2%碳酸氢钠和 1mmol/L
EDTA中将透析袋煮沸10分钟。 3. 用蒸馏水彻底清洗透析袋。 4. 放在 1mmol/L
EDTA中将之煮沸10分钟。 5.
冷却后,存放于4度,必须确保透析袋始终浸没在溶液内。从此时起取用透析袋是必须戴手套。

核心提示:一、反复冻融法:1、将细胞在-20度以下冰冻,室温融解,反复几次,由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀,使细胞一、反复冻融法:1、将细胞在-20度以下冰冻,室温融解,反复几次,由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀,使细胞结构破碎。2、至少3次以上冻溶。3、IFCC推荐法:收集细胞悬液,4℃低温离心(3000rpm,5min),弃上清,加入一定量PBS,轻轻吹打混匀,-200C
冷冻30 min,370C
解冻,如此反复3次,可形成细胞裂解液。4、用液氮冻融三四次就可以了,细胞冻住后,取出放37度水浴,溶解后震荡,再冻二、超声波处理法1、要设定好超声时间和间隙时间,一般超声时间不超过5秒,间隙时间最好大于超声时间,这些都有利于保护酶的活性。我的实验超声时间5秒、间隙时间10秒、工作次数20次。2、每个样本超声时间5秒,每个间隔5秒,粉碎5次。3、100ml菌液离心,用8ml缓冲液悬浮,加8mg溶菌酶,冰浴30min,然后超声处理。750W
40%功率。5秒超声,9秒间隔。超声至少90min。4、综合冻融和超声的方法:1500g离心,弃除上清。冰上,用小体积PBS重悬细胞。将重悬液集中,1500g离心浓缩,弃除上清。液氮骤冷。用约5倍体积的PBS缓冲液重悬细胞,并搅拌。可选择:4℃下超声破碎细胞。加入终浓度为0.25M的KCl,15mM的DTT。4℃下111500g×60min离心裂解液。取出上清。过柱子。Purification
of GST-Fusion Proteins from E. coli-Alternate
Protocol三、渗透法:冰冷的20 mmol/L Tris-Cl,2.5 mmol/L
EDTA处理,冰浴放置10min。《精编分子生物学实验指南》四、裂解液处理法:1、细胞裂解液:50
mmol/L Tris-Cl pH 6.8,100 mmol/L DTT,2%
SDS,0.1%溴酚蓝,10%甘油。SDS是阴离子型表面活性剂、极易促溶、强变性作用。2、在loading
buffer加SDS,100度5分钟,是变性方法。SDS与蛋白等量结合,可以通过条带位移判断蛋白大小,考染不会影响结果。3、如果是做小量菌液,跑PAGE胶看其表达情况的话,可以直接加蛋白loading
buffer煮沸5分钟即可,需注意的是上样前要离心12000rpm至少5分钟,然后上样时,枪头别吸最底下的。4、20毫升细胞裂解液配方:40
μL 0.5M EDTA ,4 ml 10% SDS,1 ml 1M Tris-cl,14.96 ml
蒸馏水。5、我始终未明白楼主如果想收集全蛋白,而不考虑包涵体的话,为何要用超声呢?直接水煮不就可以了吗?6、将1ml菌离心弃上清,留大概50ul,再加50ul
2×上样缓冲液,煮10min,取20ul上样,就可以了。7、检测蛋白诱导:从培养的不同时期各取出1ml,12000g×1min离心。将沉淀重悬于100ul
1×SDS上样缓冲液(50mM Tris-Cl,100mM
DTT,2%SDS,0.1%溴酚蓝,10%甘油)中,100℃加热3min,然后12000g×1min离心。上样15ul,6%SDS-PAGE电泳。《分子克隆》P8268、5-10秒离心,弃除上清,用50ul蒸馏水重悬沉淀。加入1ul
PMSF,再加入50ul热的2×SDS上样缓冲液。迅速混匀后100℃加热3-5min。将样品冰上放置,然后再溶解,煮沸1min。离心30秒。上样5ul进行SDS-PAGE电泳。2×SDS上样缓冲液:250mM
Tris-Cl,6.2%DTT,8%SDS,0.002%溴酚蓝,40%甘油。Purification of
GST-Fusion Proteins from E.
coli。9、裂解液:50mMTris-HCl,2mMEDTA,100mMNaCl,0.5%TritonX-100,1mg/ml溶菌酶。10、我们用NP40(NP40:NONIDET
p-40
乙基苯基聚乙二醇,是一种非离子表面活性剂。)加DTT和蛋白酶抑制剂裂解细胞,冰上放30-60min,然后13000rpm离心15min,取上清定量。11、裂解液配方是:50mmol/L
Tirs-HCI ,150mmol/L NaCI,0. 02% 叠氮钠,100μg/ml PMSF,1μg/ml
Aprotinin,1% Triton X-100
。12、对于组织培养中生长的细胞,最有效的裂解方法是用去污剂进行处理,溶解细胞膜并溶解蛋白质。50mmol/L
Tirs-HCl、150mmol/L NaCl、0. 02% 叠氮钠、100μg/ml PMSF、1μg/ml
Aprotinin、1% Triton X-100
,这种裂解液可能是最常用的裂解缓冲液。13、细胞裂解液的主要目的:利用去污剂破坏脂质双分子层,破裂细胞;溶解蛋白;蛋白变性使其稳定;抑制蛋白酶活性。推荐RIPA
buffer:50 mM Tris-HCl pH 7.4,150 mM NaCl,1 mM PMSF
(强大的蛋白酶抑制剂),1 mM EDTA,5 µg/ml Aprotinin,5 µg/ml
Leupeptin,1% Triton x-100,1% Sodium
deoxycholate(中度变性剂和蛋白溶解剂),0.1%
SDS(强变性剂和蛋白溶解剂)。14、裂解buffer:50mM HEPES pH7.0,1mM
甘油,1mM DTT,7M 尿素,2M硫脲(可以提高膜蛋白的融解),1mM EDTA,1mM
PMSF,1mg/ml leupeptin,1mg/ml aprotinin,1mg/ml pepstatin,50mM
NaF(anti hemoaggulating),1mM Na3VO4(inhibitor of phosphatases),2mM
benzamidine(inhibitor of
trypsin)。15、可选择:取0.5ml诱导的细胞并离心2min。弃除上清,用100ul
1×SDS上样缓冲液重悬,冰上放置。6000rpm×10min离心培养物。弃除上清,用10ml预冷的裂解液重悬沉淀。液氮骤冷细胞或-20℃冷冻细胞。在冷水中溶解细胞。15秒、4次超声处理细胞。冰浴降温。4℃,9000g×30min离心。取上清。裂解液:5
mM DTT,15 mM KCl,5 mM MgCl2,50 mM HEPES, pH 7.9,1 mM EDTA,10
mg/ml溶菌酶(临用前加上DTT和溶菌酶)。Purification of GST-Fusion
Proteins from E. coli-Basic
Protocol16、收集细胞。在液氮中突然冷冻细胞。用含有蛋白酶抑制剂的PBS缓冲液悬浮沉淀。用100
µg/ml溶菌酶处理并在冰上孵育15 min。加上10% N-laurylsarcosine
,然后超声波破碎。16000 rpm×30 min离心。取上清然后加入Triton
X-100至终浓度为2.0%。过Ni-NTA�C琼脂糖柱层析。

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