核心提示:解离/非解离native缓冲液系统很多应用蛋白质聚丙烯酰胺凝胶区带电泳(zone
electrophoresis)的研究使用一种缓冲液系

电解质

解离/非解离native缓冲液系统
很多应用蛋白质聚丙烯酰胺凝胶区带电泳(zone electrophoresis)的研究使用一种缓冲液系统,该系统的设计把所有的蛋白质分解成单一多肽亚单位。最常用的解离试剂是十二烷基硫酸钠,一种离子型去污剂,它通过包围在多肽骨架的周围变性蛋白质。在包含有过量的SDS和巯基试剂的蛋白质样品,100℃加热时,二硫键被打开,蛋白质完全解离成它的亚单位。在这些情况下,大部分的多肽以一个恒定的重量比率(1.4g SDS:1g多肽)结合多肽。与去污剂所提供的负电荷相比较,多肽固有的电荷变得微不足到。因而,根据多肽的大小,相同大小的SDS-多肽复合物基本上具有相同的负电荷、形状和凝胶中的迁移率。这种方法简洁而快速,加之只需要微克量蛋白这一事实,使SDS-PAGE成为最广泛使用的,用来确定多肽样品分子量的方法。由于几乎任何来源的蛋白质很容易被SDS溶解,所以这种方法通常都可以适用。
与之相反,用来进行非解离native电泳的非解离native缓冲液系统,则设计用来分离蛋白质混合物,而亚单位之间的相互作用、蛋白质构象和生物学活性被保留。在非解离native缓冲液系统中,蛋白质的分离基于它们的荷/质比率。
连续缓冲液系统
在连续缓冲液系统中,凝胶的缓冲液和电泳缓冲液的组成基本上是相同的。它们由单一的分离胶组成,而且全部的样品、胶和电极槽使用相同pH的同样的缓冲液离子。
在连续缓冲液系统中,分子电荷密度和胶孔大小是仅有的影响分子的堆积和条带的锐度的因素,。使用连续系统时,蛋白质在样品孔中比在凝胶中移动的速度更快。在缓冲液和分离胶的交界面,分子移动减慢,样品浓缩条带形成。这种浓缩的方法有一定的局限,尤其是分离的分子在大小上变化较大。小分子在溶液中运动和在凝胶中的运动没有太大的差别,因而在锐度方面不如对于大分子有利。
不连续缓冲液系统
不连续缓冲液系统,凝胶和电极槽中使用不同的缓冲离子和pH值,将样品加入到位于小孔分离胶的上面、非限制的大孔胶中,该胶称为浓缩胶。
不连续缓冲液系统的主要优势在于,相对较大体积的稀释的样品可以应用到胶中,而且分辨率也比连续液系统获得的要高。蛋白质在通过大孔的浓缩胶时,浓缩或堆积成狭窄的条带:在小孔的分离胶中和给定的条件下,去堆积或分离,直接的结果是分辨率的增高。Ornsten和 Davis描述的通过不连续系统产生细的起始条带。
离子的迁移和蛋白的堆积
离子的迁移依赖于分子电荷的密度和电压梯度,在给定的pH值下,只有一部分蛋白会被分离,这些分子的移动将取决于有效迁移和电压梯度,因而,如果电压和有效迁移的乘积相等,移动慢的离子可以象移动快的离子移动的一样快。
在Ornsten和 Davis系统,样品和堆积胶包含Tris-HCl缓冲液,而上电极槽包含Tris-Glycine 缓冲液。在样品缓冲液和堆积胶的pH值时,Glycine弱离子化,因而移动较慢。Chloride完全离子化,具有较高的迁移率,而蛋白的迁移介于甘氨酸和氯离子之间。一旦加以电压,氯离子离子迁移离开甘氨酸离子,产生一个低电导、高电压梯度和高pH区带。这个区带加速了甘氨酸的迁移,以使它跟上氯离子。随着甘氨酸/氯离子边界移动通过样品和堆积胶,前面的蛋白迅速地被快速迁移的氯离子超过,在正在移动界限的后面,蛋白比甘氨酸移动速度快,因此,移动的边界处理这些蛋白,有序地浓缩它们到移动减慢的薄区带。
一旦蛋白质被堆积后什么会发生?
首先,堆积蛋白可能跟在移动界面或染料前沿后面,通过低浓度胶,保持堆积或不分离。第二,蛋白可能从移动界面去堆积或分离。Ornstein和Davis描述了两种不同的去堆积的方法。去堆积能够被完成通过:a 堆积形成后减慢蛋白的移动速度,或b 一旦蛋白已经被堆积,加速后随离子的泳动速度。
第一种方法,在较高浓度的分离胶上制备低浓度的分离胶,当堆积蛋白进入高浓度分离胶中,它的移动减慢,因而要比甘氨酸离子移动速率慢。一旦这种情况发生,蛋白摆脱堆积作用,可以在相同的、较低的、局部的电场力作用下移动,就象在连续胶中一样。
第二种去堆积的方式是改变pH值,从而加快尾随离子的移动速度。 对于甘氨酸/氯系统,浓缩胶制备时,甘氨酸区带要调整到比分离胶低的pH值。当甘氨酸进入到高pH值的分离胶时,它的净负电荷将增加它的有效移动。结果,甘氨酸开始赶超一些蛋白,最后直接跟在氯离子的后面移动,从而引起蛋白的分离。
Ornstein和Davis通过在Tris-chlorde/Tris-glycine不连续缓冲系统中,用pH值为6.8的低浓度浓缩胶覆盖pH值为8.8的高浓度分离胶,合并了这两种去堆积的方法。以后Laemmli应用这种系统到SDS蛋白电泳,基本上保持了相同的特点。
堆积和pH值在SDS PAGE系统的相对的重要性
我们经常被问到,是否Novex®预制胶有浓缩胶,如果有,pH是多少。答案是肯定的,有浓缩胶(Novex®,Tris-glycine,和Trince胶),但是浓缩胶和分离胶之间的pH值相同。pH值的变化依赖于胶的成分。请参看每一个产品以确定pH值。
在应用中发现,与SDS系统中离子种类的不一致相比较,pH值的不一致在浓缩蛋白时具有较小的作用。在Laemmli系统,尽管浓缩胶的6.8的pH值对堆积系统有一个额外的促进作用,但是实际上堆积SDS/蛋白复合物并不需要。
甚至在Laemmli系统分离胶的pH值时,甘氨酸的泳动速度是足够慢,大约小于70kDa的蛋白在4%的胶中堆积,类似于在pH值6.8的浓缩胶中的堆积。应该注意到Ornstein和Davis的系统最初形成是用来分离native蛋白。他们发现有效的堆积这些蛋白中的一些需要一个低pH值的浓缩胶。然而SDS结合蛋白与native蛋白相比有一个更大的负电荷密度,结果甘氨酸的泳动速度是足够慢,即使浓缩胶配制成与分离胶相同的pH值,也能在甘氨酸区带的前缘堆积SDS结合蛋白。70kDa大小的蛋白会在pH值8.6-8.8的4%的胶和在pH值6.8-7.2的4%的胶中保持相同的堆积。
较大的蛋白也将被分离成单独的条带。堆积发生在游离样品溶液和浓缩胶之间的界面,增加了教大蛋白条带的锐度,尽管小蛋白和大蛋白在游离溶液中移动相同,但是当大蛋白接触到浓缩胶,它们的速度比小蛋白减慢的多,因而被有效的浓缩。使用典型的上样体积,浓缩效应产生覆盖全部范围的区带,这些区带与使用pH值6.8浓缩胶获得的区带有同样的锐度。
References:1 Ornstein,L. Ann.NY Acad.Sci.,121:3212 Davis,B.J. Ann.NY Acad.Sci.,121:4043 Laemmmli,U.K. Nature 227:680-685
不连续缓冲系统的比较
在电泳开始的时候, SDS-PAGE 利用不连续系统,在浓缩胶中浓缩或"堆积"样品,使其成为一条非常锐利的区带。在不连续缓冲系统中,最初胶中的阴离子不同于电泳缓冲液中开始时的阴离子。NuPAGE?系统(Bis-Tris和Tris-Acetate)和Laemmli系统二者均为不连续系统的例证,以相同的方式起作用。但是,作为NuPAGE?系统中不同离子的结果,这个系统在一个较低的pH值下工作。
Tris-Glycine系统的情况,主要包括三种离子: a) 氯,由胶缓冲液提供,由于相对于系统中其它的阴离子,阳极对它具有最高的吸引,因而充当先导离子。b) 甘氨酸,电泳缓冲液提供的主要的阴离子,由于在一个带电的环境中,它仅仅部分带有负电荷,并且保持在带有更高电荷的氯离子的后面,充当后随离子。c) Tris碱,出现在胶和电泳缓冲液中的共同的离子,在电泳时,Tris-Glycine系统中凝胶和缓冲液的离子形成了胶分离区域的9.5的工作pH值。
NuPAGE® Bis-Tris系统的情况,主要包括三种离子: a) 氯,由胶缓冲液提供,充当快速移动的先导离子。b) MES或MOPS,(取决于电泳缓冲液的选择)充当后随离子。 MES: 2- ethane sulfonic acidMOPS: 3- propane sulfonic acid c) Bis-Tris碱充当出现在胶中的共同离子,Tris由电泳缓冲液提供。 合并低pH值的胶缓冲液和电泳缓冲液(pH7.3-7.7)导致了电泳时显著降低的工作pH值。
NuPAGE® Tris-Acetate系统的情况,主要包括三种离子: a) Acetate,来自于凝胶缓冲液先导离子。b) Tricine,来自于电泳缓冲液的后随离子。c) Tris,共同离子。 这个系统也在一个比Tris-Glycine系统显著低的pH值下运行。下图总结了每一个系统的浓缩胶的迁移差别。
不同缓冲系统的分子量标准的精确校准
通常,SDS胶中蛋白的迁移是处于完全变性状态下蛋白长度的函数。通过与已知分子量大小的蛋白标准的标准曲线比较,根据样品蛋白的相对移动来推断它的分子量。但是,当在不同的SDS-PAGE缓冲液系统进行电泳时,相同的分子量标准可能有轻微不同的迁移,因而导致明显不同的分子量差别。
二级结构的作用
使用SDS-PAGE进行分子量校准,与一个蛋白的真实的分子量(绝对的校准来自于已知的氨基酸序列)的轻微的偏离可能发生,主要是由于保留的不同程度的蛋白的二级结构,即使是存在SDS。在具有高度组织的二级结构的蛋白(例如胶原蛋白,组蛋白,或高度疏水的膜蛋白)和相对于肽总的大小,局部二级结构的效应变得扩大的多肽,这种现象变得更加普遍。
pH值的影响
当相同的蛋白在不同的SDS-PAGE缓冲系统进行电泳时,也可以观察到蛋白迁移的轻微差别的发生。每一个SDS PAGE 缓冲系统具有不同的pH值,这将影响蛋白的电荷量和结合SDS的能力。尽管天然蛋白迁移的改变通常很小,但是"非典型"或者化学修饰的蛋白,如预染的标准,变化很显著。
蛋白移动的例证
有例证表明,当MulitiMark® Muli-Colored 标准,在Tris-Glycine胶上电泳时,与在NuPAGE® Novex Bis-tris胶上,使用MES SDS或者 MOPS SDS电泳缓冲液比较,发生了蛋白迁移改变的情形。与Tris-Glycine系统比较,MulitiMark®标准在NuPAGE® Novex Bis-tris缓冲系统中两个肌红蛋白(myoglobin)位置颠倒。这一现象可以通过应用在NuPAGE系统电泳的MulitiMark®标准再次计算值来解决。
计算和指示的分子量
当前Novex®分子量标准提供的表观分子量值来源于在Tris-Glycine SDS-PAGE系统。我们已经计算和指示了在几种电泳胶/缓冲系统中Novex® pre-stained markers 的表观分子量,包括Novex® Tricine 胶系统和NuPAGE® Novex系统。记住要使用与你的凝胶匹配的分子量,以最精确地校准你的目的蛋白。你也可以在你的实验室使用选择的缓冲系统用作Novex?标准作标准曲线。
批与批之间分子量一致性
需要记住的重要一点是,假说凝胶使用相同的缓冲系统,invitrogen生产的所有的标准,从一个批号到另一个批号,从一块胶到另一块胶,经过严格质量控制以达到的迁移一致。

抗原与抗体发生特异性结合后,虽由亲水胶体变为疏水胶体,若溶液中无电解质参加,仍不出现可见反应。为了促使沉淀物或凝集物的形成,常用0.85%氯化钠或各种缓冲液作为抗原及抗体的稀释液。由于氯化钠在水溶液中解离成Na+和C1-,可分别中和胶体粒子上的电荷,使胶体粒子的电势下降。当电势降至临界电势以下时,则能促使抗原抗体复合物从溶液中析出,形成可见的沉淀物或凝集物。

酸碱度

抗原抗体反应必须在合适的pH环境中进行。蛋白质具有两性电离性质,因此每种蛋白质都有固定的等电点。抗原抗体反应一般在pH为6~8进行。PH过高或过低都将影响抗原与抗体的理化性质,例如pH达到或接近抗原的等电点时,即使无相应抗体存在,也会引起颗粒性抗原非特异性的凝集,造成假阳性反应。

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